Protein hay còn gọi là chất đạm là thành phần quan trọng của mọi sự sống trên trái đất. Thiếu hay dư protetin đều ảnh hưởng đến sức khỏe chúng ta. Có nhiều phương pháp giúp phân tích nồng độ protein như phương pháp Dumas, sử dụng tia UV, phương pháp Biuret… Tuy nhiên phương pháp được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng nhất là phương pháp Kjeldahl. Trong bài viết này mình sẽ giới thiệu cách hoạt động, ưu và nhược điểm của phương pháp phân tích đạm Kjeldahl.
Phương pháp Kjeldahl là gì?
Đây là phương pháp giúp xác định hàm lượng nitơ trong các hợp chất hữu cơ và vô cơ. Phương pháp phân tích nitơ của Kjeldahl là tiêu chuẩn trên toàn thế giới để tính toán hàm lượng protein trong nhiều loại vật liệu khác nhau, từ thức ăn của người và động vật, phân bón, nước thải và hóa thạch.
Phương pháp Kjeldahl được phát triển vào năm 1883 bởi một nhà sản xuất bia tên là Johann Kjeldahl. Một loại thực phẩm được tiêu hóa bằng một axit mạnh để nó giải phóng nitơ có thể được xác định bằng một kỹ thuật chuẩn độ phù hợp.
Đây là một phương pháp chính và được nhiều tổ chức công nhận như AOAC, USEPA, ISO, DIN, Pharmacopeias.
Phương pháp Kjeldahl gồm những quy trình nào?
Phương pháp Kjeldahl bao gồm ba bước, phải được thực hiện theo đúng thứ tự các bước sau:
- Chuyển đổi nitơ amin thành ion amoni trong môi trường H2SO4. Đây còn gọi là quá trình tiêu hóa.
- Chưng cất: Chuyển đổi ion amoni thành khí amoniac.
- Chuẩn độ: Lượng amoniac được xác định bằng cách chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn. Sau đó ta sẽ xác định được hàm lượng nitơ.
Chi tiết cách thực hiện các quy trình trên gồm:
Bước 1: Phân hủy chất hữu cơ
Mục đích của quy trình phân hủy này là là phá vỡ tất cả các liên kết nitơ trong mẫu và chuyển đổi tất cả liên kết nitơ thành các ion amoni (NH4+). Hợp chất carbon và hydro tạo thành carbon dioxide và nước.
- Cân khoảng 1 gm mẫu chứa protein, ghi chú trọng lượng và đặt mẫu vào bình phân hủy, cùng với 12-15 ml axit sulfuric đậm đặc (H2SO4).
- Thêm 7g kali sulfat và chất xúc tác, thường là đồng.
- Đưa ống / bình phân hủy và hỗn hợp đun sôi (khoảng 370 o C đến 400 o C).
- Đun nóng hỗn hợp trong ống / bình cho đến khi có thể nhìn thấy khói trắng, và sau đó tiếp tục gia nhiệt trong khoảng 60-90 phút.
- Làm mát ống / bình và từ từ thêm 250 ml nước.
Tốc độ phân hủy có thể được cải thiện rất nhiều bởi việc bổ sung muối nitrat và chất xúc tác. Kali sulfat được thêm vào để tăng điểm sôi của axit sunfuric và chất xúc tác được thêm vào để tăng tốc độ và hiệu quả quá trình phân hủy. Các tác nhân oxy hóa cũng có thể được thêm vào để cải thiện tốc độ phản ứng.
- PTPƯ: Protein (-N) + H2SO4 = (NH4)2SO4 + CO2 + H2O
Bước 2: Chưng cất
Trong bước chưng cất các ion amoni (NH4+) được chuyển thành amoniac (NH3) bằng cách thêm kiềm (NaOH). Amoniac (NH3) được chuyển vào bình thu bằng phương pháp chưng cất hơi nước.
- NH4)2SO4 + 2NaOH = 2NH3+ Na2SO4 + 2H2O
Khí amoniac sinh ra được giải phóng khỏi dung dịch và di chuyển ra khỏi bình phân hủy và vào bình tiếp nhận, nơi chứa một lượng dư axit boric. Độ pH thấp của dung dịch trong bình tiếp nhận chuyển đổi khí amoniac thành ion amoni và đồng thời chuyển axit boric thành ion borat:
- NH3 + H3BO3 (axit boric) = NH4 + + H2BO3
Bước 3: Chuẩn độ
Nồng độ của các ion amoni thu được có thể được xác định bằng hai loại chuẩn độ:
Khi sử dụng dung dịch axit boric làm dung dịch hấp thụ, việc chuẩn độ axit-bazơ được thực hiện bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn của axit sunfuric hoặc axit clohydric và hỗn hợp các chất chỉ thị. Tùy trên lượng ion amoni có mặt, nồng độ trong khoảng 0,01N đến 0,5N là đã sử dụng. Ngoài ra, điểm cuối có thể được xác định bằng phương pháp đo điện thế bằng điện cực pH. Cách này được gọi là chuẩn độ trực tiếp.
- B(OH)O4 – + HX = X– + B(OH)3 + H2O (HX là loại axit mạnh)
Khi sử dụng dung dịch chuẩn axit sunfuric làm dung dịch hấp thụ, axit sunfuric dư (phần dư không phản ứng với NH3) được chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn natri hydroxit và chênh lệch lượng amoniac được tính toán. Chuẩn độ này được gọi là chuẩn độ trở lại.
- H2SO4+ 2NH3 = SO42- + 2NH4+
Công thức xác định nồng độ phần trăm nitơ
Việc tính toán% nitơ hoặc% protein phải tính đến loại dung dịch nào đã được sử dụng và bất kỳ yếu tố pha loãng được sử dụng trong quá trình chưng cất. Phương trình sau đây có thể được sử dụng để xác định nồng độ phần trăm nitơ của mẫu nặng m gam bằng dung dịch axit HCl x M để chuẩn độ:
Trong đó vs và vb là thể tích chuẩn độ của mẫu và mẫu trắng và 14g là khối lượng phân tử của nitơ N. Một mẫu trắng thường được chạy cùng lúc với vật liệu được phân tích để tính đến bất kỳ nitơ dư nào có thể trong các thuốc thử được sử dụng để thực hiện phân tích. Khi hàm lượng nitơ đã được xác định nó được chuyển đổi sang một hàm lượng protein bằng cách sử dụng thích hợp chuyển đổi yếu tố: % Protein = F % N.
Ưu và nhược điểm phương pháp Kjeldahl
Ưu điểm: Phương pháp Kjeldahl được sử dụng rộng rãi trên phạm vi quốc tế và vẫn là phương pháp tiêu chuẩn để so sánh với tất cả các phương pháp khác. Tính phổ biến, độ chính xác cao và khả năng tái sản xuất tốt đã khiến nó trở thành phương pháp chính để ước tính protein trong thực phẩm.
Nhược điểm: Nó không đưa ra thước đo về protein thực sự, vì tất cả nitơ trong thực phẩm không ở dạng protein. Các protein khác nhau cần các yếu tố hiệu chỉnh khác nhau vì chúng có trình tự axit amin khác nhau. Việc sử dụng axit sunfuric đậm đặc ở nhiệt độ cao gây ra một mối nguy hiểm đáng kể, cũng như việc sử dụng một số chất xúc tác có thể có. Kỹ thuật này rất tốn thời gian để thực hiện.
Phương pháp Kjeldahl là cách hiệu quả nhất giúp xác định hàm lượng và nồng độ phần trăm nitơ trong các phòng thí nghiệm, trung tâm nguyên cứu hay kiểm nghiệm.
